Lalka-фаги и их загадочные враги
В 2023 году мы побывали на острове Кунашир и выделили из тамошних горячих источников несколько странных, похожих друг на друга бактериофагов. Вирионы одного из этих фагов мы с помощью коллег из МГУ сфотографировали на электронном микроскопе. Выглядят они вот так:
Когда мы отсеквенировали и собрали геномы этих фагов, оказалось, что все они кодируют CRISPR кассеты с вариабельными наборами спейсеров. Этих фагов мы назвали Lalka - потому, что они показались нам смешными. Среди ранее опубликованных полных геномов бактериофагов ничего похожего найти не удалось - однако среди опубликованных метагеномных сборок нашлось несколько обрывков Lalka-подобных фагов.
Бактериофаги нередко несут в геномах CRISPR-кассеты, но собственных cas-генов у них при этом обычно нет — они пользуются Cas белками хозяина. Однако CRISPR кассеты Lalka-фагов слишком сильно отличались от всех известных CRISPR-cas систем Thermus. После детального анализа геномного контекста и серии экспериментов выяснилось, что Lalka-фаги кодируют свою собственную CRISPR-Cas систему V типа, которая принадлежит к ранее неизвестному подтипу.
Система оказалась рабочей и активной - в наших экспериментах она защищает клеток от инфекции бактериофагами, несущими протоспейсер, а также подавляет трансформацию плазмид при таргетировании. Но для чего бактериофагам нужны эти CRISPR-Cas системы? Спейсеры, обнаруженные в кассетах изолированных фагов и метагеномных контигах, таргетируют необычную группу мобильных элементов Thermus.
Все эти элементы кодируют тирозиновые интегразы и используют гены тРНК для встраивания в клеточный геном. В остальном наборы генов у таргетируемых элементов сильно варьируются - можно лишь сказать, что большинство таких элементов кодируют гены с предсказанными функциями праймазы/полимеразы и хеликазы - вероятно, это репликативные модули.
Анализ происхождения спейсеров показывает, что Lalka-фаги, видимо, конкурируют с таргетируемыми мобильными элементами. Пока что нам не удалось выяснить подоплеку этой конкуренции, но мы предполагаем, что эти интегративные элементы могут вести себя как сателлиты Lalka-фагов.
А еще мы исследовали транскриптом клеток Thermus thermophilus, зараженных фагом Lalka27a и обнаружили, что в самом начале инфекции активнее всего экспрессируюся два гена, которые кодируют маленькие отрицательно заряженные белки (Gp5 и Gp6). Мы предполагаем, что эти белки могут мимикрировать под ДНК и ингибировать клеточные защитные системы, такие как системы рестрикции-модификации, хотя этого еще не проверяли.
Также вирионы Lalka-фагов содержат несколько белков, которые, вероятно, впрыскиваются внутрь клетки при инфекции. Один из этих белков - DarB, который, как мы предполагаем, подавляет системы рестрикции-модификации, подобно своему гомологу из фага P1. Второй белок, названный нами Lvh (Large virionic helicase) - очень большой белок, порядка 1700 аминокислотных остатков, содержит всего лишь один надежно идентифицируемый домен с хеликазной функцией. Есть еще один вирионный белок Gp4, но его структуру даже AF3 нормально предсказать не может. Словом, много всего загадочного есть у этих бактериофагов.